BIOMOLO 7

odmiany PCR

RT-qPCR, Real Time PCR, Multiplex PCR, RFLP PCR, Nested PCR

METODY SEKWENCJONOWANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH

MAXAMA GILBERTA, SANGERA, SEKWENCJONOWANIE CYKLICZNE, PÓŁAUTOMATYCZNE,

SEKWENCJONOWANIE NOWEJ GENERACJI

Pirosekwencjonowanie, Metoda SOLEXA, metoda SOLID, metoda VisiGwn, metoda nanoporowa

Metody do wykrycia mutacji nieznanych

PCR-RFLP, ASO, SSCP, DGGE, HDA, CMC, DHPLC, HRMA

RT-qPCR

używana jest odwrotna transkryptaza, która syntentetyzuje cDNA na matrycyny mRNA (wcześniej trawionego DNAzami, aby uzyskać czystą matrycę), gdyż cDNA jest stabilniejsze od mRNA; samo PCR przebiega klasycznie

Real Time PCR

używane są radioaktywne nukleotydy, fluorochromy rezonansowe lub sondy Taq oznakowane bromkiem etydyny (5’ barwnik, na 3’ cząstka wygaszająca barwnik) - mogą łączyć się ze specyficzną bądź niespecyficzną sekwencją

Multiplex PCR

powstanie wielu matryc podczas jednej reakcji; wykorzystuje się różny zestaw starterów (może to doprowadzać do błędów), które powinny mieć odpowiednią długość, zawierać 35-60% cytozyny i guaniny, a także topnieć w temperaturze 55-60 °C

RFLP PCR

powstały produkt trawiony jest enzymami restrykcyjnymi, a szczególnie konkretną sekwencję DNA; rozpoznawane są również sekwencje palindromowe powstają dwa krótsze łańcuchy DNA, które rozdziela się w żelu agarozowym

Nested PCR

występuje w dwóch etapach: po pierwszym mogą powstać niespecyficzne produkty DNA (matryca do drugiego etapu), które w drugim są niwelowane; etap przy pomocy specjalnych starterów tzw. Primerów zewnętrznych zlokalizowanych w DNA

metoda Maxama GILBERTA

jedno- lub dwuniciowe fragmenty DNA znakuje się na 5’ końcu fosforem-32, biotyną, streptawidyną lub fluorescencyjnymi starterami; następnie używa się odczynników chemicznych modyfikujących zasady azotowe, tak aby degradować DNA w określonym miejscu:

PIPERYDYNA OPIS DZIALANIA

tnie wiązanie N-glikozydowe i fosfodiestrowe na końcu 3’ w miejscu przed zmodyfikowaną zasadą. Otrzymujemy cząsteczki o wyznakowanym, identycznym końcu 5’, zaś koniec 3’ posiada różną długość.

Metoda Sangera

opis

sekwencjonowanie cykliczne

wykorzystywany jest jedno- lub dwuniciowy DNA, produkt PCR, który musi być uprzednio oczyszczony; przebieg podobny do PCR, jednak używa się jednego startera i przeprowadza cztery reakcje – dla każdego ddNTP osobno;

sekwencjonowanie półautomatyczne

w tej metodzie zamiast znaczników radioaktywnych używa się znaczników fluorescencyjnych, co jest o wiele bezpieczniejsze, umożliwia przeprowadzanie jednej reakcji z wszystkimi ddNTP; wyniki przechowuje się na komputerze.

pirosekwencjonowanie

polega na syntezie komplementarnej nici podczas czego mierzy się poziom uwalnianego pirofosforanu, który reagując z sulfarazą i lucyferazą uwalnia strumień fotonów; syntetyzowanie różnych zasad również powoduje emisję światła o różnej intensywnosci